除了ceRNA，circRNA研究还能怎么做？|转录调控专题
越来越多的科研工作者开始意识到ceRNA调控网络的重要性并将目光聚焦在非编码RNA（比如circRNA）的ceRNA调控功能上。
相对而言，ceRNA调控关系更容易通过miRNA靶基因预测工具分析获得，已经成为一部分研究人员在circRNA功能研究时优先考虑的功能机制模型。
但是ceRNA调控机制毕竟是circRNA众多功能机制中的一种，当发现目标功能circRNA并不是通过ceRNA调控机制起作用时，还能从哪些方向探索circRNA功能的具体机制呢？
2019年坦普尔大学Lewis Katz医学院转化医学中心的研究人员在Nature Communication发表了circRNA在心血管健康与疾病中的相关研究。
在美国心血管疾病是主要的死亡原因之一，约占七分之一，尽管经典的药物治疗策略得到了改善，但心衰患者的生存率和预后仍然很差，突出了需要进一步了解心血管疾病的潜在机制和开发创新的有效疗法的必要性。
为了开展相关研究，研究人员构建了心肌梗死（MI）小鼠模型，并从假手术组（Sham）和MI组（MI造模后3天）各取2个心脏边界区样本进行circRNA芯片检测分析。
在14236个小鼠circRNA探针中检测到1723个circRNA表达，其中82个circRNA在组间存在表达差异，包含41个差异上调circRNA和41个差异上调circRNA。
研究人员使用热图（下图a）展示circRNA的相对表达水平和变化趋势（热图中使用circ外加其来源基因的基因名组合进行circRNA命名，比如circFndc3b，通常情况下我们只需要对自己开展功能研究的circRNA进行命名），通过发散引物（Divergent Primer，参见circRNA测序介绍的引物设计部分）和RT-qPCR检测了一些circRNA存在差异表达（下图b），其中circFndc3b下调比较明显。
随后研究人员检测了circRNA在更长时间跨度下的表达水平，发现circFndc3b在MI后6周表达水平依然继续降低（下图c），而Fndc3b的mRNA水平没有变化，表明了circFndc3b而非Fndc3b mRNA与MI的相关性。
使用流式细胞分选并检测分选细胞中的circFndc3b水平，发现circFndc3b在内皮细胞和心肌细胞中明显下调（下图1d，e），而在成纤维细胞中没有明显差异。
通过circRNA芯片结合RT-qPCR，研究人员发现circFndc3b在MI后表达下调，且与MI存在相关性。
使用动物模型进行相关疾病研究的常见问题之一是目标分子或机制是否在人中同样存在，是否具有临床意义。
研究人员发现人中存在circFndc3b的同源circRNA，且相较于非衰竭的心脏，人circFndc3b同源circRNA在心肌病患者左室组织的表达也显著减少，显示出一致的趋势，表明circFndc3b可能具有临床意义，并参与MI的病理生理学。
circFndc3b由Fndc3b的2号外显子和3号外显子组成，为了了解circFndc3b在心血管生物学中的作用，研究人员构建了小鼠心脏内皮细胞（MCEC）circFndc3b过表达模型，并使用表达谱芯片检测过表达circFndc3b后表达变化基因（下图左a）。
在差异基因中研究人员注意到了VEGF-A，VEGF-A是有效的心脏保护分子，且RT-qPCR显示VEGF-A因circFndc3b过表达而上调（下图左b）。circFndc3b的过表达显著降低MCEC（下图左c、d）和心肌细胞的凋亡，同时显著提高内皮细胞管形成能力，说明circFndc3b在体外调节内皮细胞功能。
在体内，研究人员测试circFndc3b的外源传递（基于AAV9）是否会减轻小鼠MI后的左心室重塑和功能障碍。小鼠MI模型中circFndc3b的外源传递显著改善了％EF（ejection fractions，射血分数）和％FS（fractional shortening，缩短分数）。
对收缩期（LVIDs）和舒张期（LVIDd）期间的LV内径的分析显示，通过circFndc3b过表达可明显恢复LV（左心室）尺寸，增强了小鼠心肌梗死后的新生血管形成并减少了纤维化。
体外和体内实验共同表明circFndc3b可以调节心肌梗死后的心脏修复（下图右）。
circRNA被报道可以充当miRNA海绵而发挥功能，为了探索circFndc3b是否通过miRNA海绵而发挥调控功能，研究人员使用miRanda和TargetScan预测circFndc3b上的miRNA反应元件（MREs），发现circFndc3b可能与miR-93-3p、miR-412-3p、miR-298-5p、miR-7231-3p和miR-6998-3p结合（可以使用omicstudio平台预测miRNA靶基因或参考miRNA靶基因预测介绍章节）。
萤光素酶报告基因实验表明circFndc3b可以结合miR-298-5p，miR-412-3p和miR-93-3p，且miRNA表达水平在心肌梗死后心脏的左心室组织中通常会升高。
为了确定circFndc3b功能是否需要miR-93-3p、miR-298-5p、miR-412-3p结合位点，研究人员生成了一个突变的circFndc3b过表达质粒，其中所有预测的miR-93-3p、miR-298-5p和miR-412-3p位点都发生了突变。
在处于缺氧（1% O2）和血清剥夺状态的H9c2细胞模型中，野生型circFndc3b和突变型circFndc3b的过表达都降低了凋亡水平，表明circFndc3b上的miRNA靶向位点在体外是可有可无的。
在MCEC中的研究中也发现位点突变不影响circFndc3b对内皮细胞管形成能力的作用、不影响circFndc3b对MCEC凋亡抑制，表明circFndc3b在内皮细胞或心肌细胞中都不能作为miRNA海绵，同时通过AAV9递送体系的体内研究也表明circFndc3b不作为miRNA海绵。
如果体内和体外的实验表明circRNA不作为miRNA海绵发挥功能，无疑让很多想从ceRNA调控机制入手的研究者陷入困境。
即使通过生信预测能预测到候选的miRNA，通过萤光素酶报告基因实验证明了circRNA与miRNA的结合，但在功能评价上，circRNA上的miRNA结合位点对于circRNA作用不一定是必须的或者不是主要的调控因素，因此建议不要把某种分子机制模型作为机制探索唯一的路或者将自身局限在ceRNA调控机制。
先功能，后机制，即先通过功能研究或功能筛选确定候选circRNA，再去探索可能的分子机制。
排除了miRNA海绵作用后，研究人员继续探索circFndc3b是否通过与RNA结合蛋白相互作用来发挥作用。
研究人员使用CircInteractome预测了circFndc3b可能结合的蛋白（参见circRNA常见数据库部分），发现circFndc3b可能具有AGO2和FUS的结合位点。
通过RIP（RNA immunoprecipitation）-qPCR发现circFndc3b在FUS下拉中显著富集，而在AGO2下拉中没有富集，而AGO2是RNA诱导的沉默复合物（RISC）的核心成分，再一次说明在MCECs中circFndc3b不是通过miRNA海绵发挥作用。
circFndc3b分布于MCECs的细胞核和细胞质中，其过表达显著降低了FUS水平。
当野生型或突变体circFndc3b过表达时，VEGF-A水平显著增加。敲低circFndc3b或者过表达FUS，可以抑制VEGF-A的表达，促进MCECs的凋亡，抑制内皮细胞的迁移能力。
过表达circFndc3b可促进VEGF-A的表达，抑制内皮细胞MCECs的凋亡，提高内皮细胞的迁移能力；当过表达circFndc3b同时过表达FUS或者敲低FUS，则相应地起到拮抗或者协同促进的生物学效应。
相关的实验表明circFndc3b、FUS和VEGF之间存在相互作用，VEGF是FUS的下游蛋白，circFndc3b可能通过FUS调控VEGF-A的表达。
同时MI模型的体内数据表明circFndc3b过表达的左心室组织中FUS表达水平明显下调，而VEGF表达水平出现上调。
总之研究表明circFndc3b-FUS-VEGF信号传导可以调节体外和体内的血管生成。
研究人员基于MI小鼠模型，使用circRNA芯片检测发现circFndc3b在MI造模三天后表达水平显著下调，流式细胞分选结合RT-qPCR发现circFndc3b在内皮细胞和心肌细胞中明显下调，后续体外实验选择MCEC和心肌细胞作为为研究模型。
通过体外和体内实验表明circFndc3b可以调节心肌梗死后的心脏修复。在机制上，研究人员首先考虑了circRNA的miRNA海绵作用，但通过构建突变体结合体内、外实验发现circFndc3b没有发挥miRNA海绵功能，同时在后续的AGO2的RIP-qPCR实验中也得到了印证。
在排除miRNA海绵作用（或ceRNA调控机制）后，研究人员使用CircInteractome结合RIP-qPCR筛选到了circFndc3b的互作RNA结合蛋白FUS。
通过结合基因表达谱芯片的检测结果和先前的研究，发现有效的心脏保护分子VEGF与circFndc3b的关联性，最后通过敲低与过表达实验确定VEGF是FUS的下游蛋白，从而建立调控体内和体外的血管生成的circFndc3b-FUS-VEGF调控轴。
在circRNA研究时，可以通过相关综述文章了解circRNA功能的一般机制，比如miRNA海绵、结合RNA结合蛋白、翻译多肽等，在有相关需要时可以使用全转录组测序、RNA pull down结合质谱、翻译组测序（Ribosome profiling sequencing）等组学技术辅助检测分析。
此外也可以使用公开数据库（CircInteractome、Starbase、TransCirc等）查询或预测相关信息辅助于课题的开展与推进，关于数据库部分可以关注本书的其他数据库介绍章节。
1.Garikipati VNS, Verma SK, Cheng Z, Liang D, Truongcao MM, Cimini M, Yue Y, Huang G, Wang C, Benedict C, Tang Y, Mallaredy V, Ibetti J, Grisanti L, Schumacher SM, Gao E, Rajan S, Wilusz JE, Goukassian D, Houser SR, Koch WJ, Kishore R. Circular RNA CircFndc3b modulates cardiac repair after myocardial infarction via FUS/VEGF-A axis. Nat Commun. 2019 Sep 20;10(1):4317. doi: 10.1038/s41467-019-11777-7. Erratum in: Nat Commun. 2020 May 1;11(1):2234. PMID: 31541092; PMCID: PMC6754461.
2.Kristensen LS, Andersen MS, Stagsted LVW, Ebbesen KK, Hansen TB, Kjems J. The biogenesis, biology and characterization of circular RNAs. Nat Rev Genet. 2019 Nov;20(11):675-691. doi: 10.1038/s41576-019-0158-7. Epub 2019 Aug 8. PMID: 31395983.
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